如何建立一個標準的PCR實驗室？

點擊數(shù)：11632022-12-23 11:37:29　來源: 重慶實驗臺_重慶通風柜_重慶實驗室家具_重慶哥爾摩工程技術(shù)有限公司

臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗，近年來對這類實驗室的建設(shè)越來越得到重視，因為它對檢測結(jié)果的可靠性、準確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。

一、PCR實驗室平面布局

臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過傳遞窗進行。

二、實驗室空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制

PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。

1.試劑貯存和準備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。

2.標本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。

3.擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū)) 的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū)) 制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加氧等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。

4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。

本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。

三、污染的預(yù)防與控制

PCR實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

1.工作區(qū)域的嚴格劃分

（1）各個實驗區(qū)域設(shè)置合理。

（2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

2.合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）合理的空調(diào)通風系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)。

（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

3.規(guī)范地操作

（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術(shù)人員必須進行上崗培訓，經(jīng)培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作。

（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。

（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設(shè)備還應(yīng)進行高壓消毒處理。

4.嚴格地管理

（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關(guān)的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設(shè)置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門。

（2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域。

（3）盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。

（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等。

（5）擴增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防護。

5.完備的實驗室配套設(shè)施

完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。

四、PCR實驗室建設(shè)常用標準規(guī)范

《實驗室生物安全通用要求》國家標準GB19489-2008

《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》衛(wèi)醫(yī)發(fā)【2002】8號文

《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)【2002】10號文

《臨床基因擴增檢驗實驗室設(shè)計標準》衛(wèi)醫(yī)發(fā)【2002】10號文附件

《基因檢驗實驗室技術(shù)要求》國家質(zhì)監(jiān)檢驗總局SN/T1193-2003

《潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境-生物污染控制》國際標準ISO14698

《潔凈廠房設(shè)計規(guī)范》國家標準GB500732013

《潔凈室施工及驗收規(guī)范》GB50591-2010

《室內(nèi)空氣質(zhì)量標準》國家標準GB/T18832002

《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》國家標準GB50346-2011

《病原微生物實驗室生物安全管理條例》衛(wèi)生部（2004-11-12）